摘要：对云南地区栽培的大叶茶（Camelia sinensis var.assamica）9个居群和大理茶（C.taliensis）3个居群的遗传多样性和居群遗传结构进行了比较研究。通过对94条叶绿体DNA RPL32-TRNL序列的核苷酸序列变异进行分析，共发现了7个单倍型。研究结果表明：大叶茶（h=0.728π=0.00469）比大理茶（h=0.610π=0.00225）拥有更为丰富的遗传变异，但其居群遗传分化水平（Gst=0.580，Fst=0.612）却低于大理茶（Gst=0.696，Fst=0.773）。AMOVA分析进一步证实了它们的遗传变异主要存在于居群间，且大叶茶（61.21%）低于大理茶（77.34%）。相对于大理茶，遗传多样性水平在本研究所取的大叶茶居群间存在着较大的差异，单倍型多态性水平变化范围为0~0.809，核苷酸多态性水平变化范围为0~0.00487。最后，讨论并提出了科学有效地保护我国古茶园茶种资源的建议和对策。

关键词：大叶茶；大理茶；叶绿体DNA；遗传多样性；古茶园；RPL32-TRNL

茶〔Camellia sinensis(L).O.Kuntze〕作为世界三大饮料植物之一，在分类学上属于山茶科（Theaceae）山茶属（Camellia）之茶组（sect. Thea）。在茶组植物12个种中，仅有茶（C.sinensis）这一种在世界范围内被广泛栽培（闵天禄，2000）；但在亚洲的部分地区，尤其是我国的云南，大理茶（C.taliensis）和厚轴茶（C.crassicolumna）等茶组植物也被当地居民长期引种栽培（陈进和裴盛基，2003）。

民族植物学及语言学证据表明，云南及其邻近地区的原住民有着悠久的种植和利用茶叶的历史（陈进和裴盛基，2003）。至今，在云南的临沧、普洱和西双版纳等地区，还保存有大量明、清时代建立的古茶园，其中种植的茶树主要为大叶茶（C.sinensis var.assamica）（编者注：即普洱茶）。作为茶（C.sinensis）的重要野生近缘种，大理茶（C.taliensis）与大叶茶在形态特征上十分相似，主要区别在于顶芽、幼枝和叶片均无毛，花柱5裂、无毛，子房5室、被绒毛。野生大理茶居群主要分布在我国云南西部、西南部和毗邻的缅甸北部、泰国北部（闵天禄，2000）。此外，在澜沧江流域地区也零星分布有少量的栽培大理茶古茶园。这些珍贵的古茶园不仅为栽培茶树的起源、驯化研究提供了丰富的素材，也是未来进行茶树遗传改良不可多得的宝贵基因来源。

近几十年来，由于大面积毁林开荒、工程建设破坏以及单一化现代茶园替代，加之对古茶树进行砍伐和过度采摘的事件屡屡发生，导致古茶园面积急剧减少。云南古茶园种质资源面临着严重的破坏和威胁，因此加强对古茶园的保护刻不容缓。本研究利用叶绿体DNA RPL32-TRNL片段的序列变异对栽培大叶茶和大理茶居群进行了研究，旨在评价栽培大理茶和大叶茶居群的遗传多样性和居群遗传结构，阐明栽培大理茶与大叶茶之间的进化关系，为栽培古茶园种质资源的保护策略的制定提供科学依据。

1材料和方法

1.1 实验材料

本实验选取了在云南具有地理代表性的栽培大理茶3个居群和栽培大叶茶9个居群进行研究（具体地理位置见表1）。每个研究居群取7~9个树体高大的个体，取样个体间至少间隔10m，采集幼嫩叶片，硅胶迅速干燥，放置于自封袋中保存。茶组植物的种间存在着较高的杂交亲和性（Takeda，1990），野外考察发现有些植株形态上介于大理茶和大叶茶之间，这些个体可能为两者之间的杂交后代。为了更好地比较和追溯栽培的大理茶和大叶茶之间的居群进化历史，本研究所选择的居群在形态上都能非常明显地区分两个分类单元，不存在形态上的过渡性材料。凭证标本保存于中国科学院昆明植物所标本馆（KUN）。

1.2 DNA提取和PCR扩增

硅胶干燥的叶片采用改良的CTAB法（唐玉海等，2007）提取总DNA。PCR引物序列依据Shaw等（2007）所述，分别为IRNL（5'-CTG CTT CCT AAG AGC AGC GT-3'）和RPL32（5'-CAG TTC CAA AAA AAC GTA CTT C-3'）。扩增反应在50μ1反应体系中进行（浓度均为终浓度）:1×PCR buffer，两端引物各0.1μmol。L-1，dNTPs0.1mmol，L-1，Tao聚合酶0.5U以及约50 ng模板DNA。扩增反应程序为：97℃预变性4min，94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min，共32个循环；最后72℃延伸10min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，割取目的条带，用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒（上海生工）进行纯化，纯化产物送至深圳华大基因研究院测序。测序引物为扩增引物，利用正反向引物分别对两条链进行测序。

1.3 数据分析

利用软件BIOEDIT（Hall，1999）对序列进行比对，并加以手工调整。参照Caicedo and Schaal（2004）的方法，将长度大于1个碱基的插入/缺失处理为单碱基的插入/缺失。所有的插入/缺失位点被视为第五碱基， 并进行了重新编码。运用DNASP4.10（Rozas等，2003）软件统计了叶绿体DNA RHL32-TRNL片段的单倍型，并分别在分类单元水平和居群水平对核苷酸多态性（π）（Nei and Li,1979），单倍型多态性（h）和分离位点数目（S）进行了检测。利用DNA SP4.10软件对居群间遗传分化系数（Gst）和居群间的平均基因流（Nm）（Nei,1973）进行了估算。利用TCS1.2软件（Clement等，2000）构建了cpDNA RPL32-TRNL片段的单倍型网络图。这种方法应用溯祖理论（coalescenttheory）来推测单倍型的亲缘关系，基于统计简约性产生单倍型网状关系并保存了单倍型之间95%的最简约节点。

应用ARLFQUIN3.0（Excoffier等，2005）对分类单元和居群进行遗传结构的分子方差分析（AMOVA,analysis ofmolecular variance）（Excoffier等，1992）。运用ARLEQUIN3.0软件包中的Mantel统计学检验（Mantel,1967），分别对栽培大叶茶和大理茶的居群间遗传分化系数Fst与地理距离之间的相关性进行了检验。

2 结果

2.1 序列变异分析

对12个居群94个个体的cpDNA RPL32-TRNL非编码区片段进行了测序，比对后序列长度为930Bp，共检测到7种不同的单倍型。通过对单倍型序列间进行比对，共发现了14个变异位点（表2），包括10处碱基替换（substitutions）和4处插入/缺失（indels）。其中10处替换分别为：在166bP（T↔C）、285 bP（A↔G）、356 bp（A↔G）、549 bP（A↔G）、689 bp（T↔C）和727 bP（A↔G）处各有一个碱基转换（transition）；在145 bP（R↔G）、476 bP（C↔G）、579 bP（C↔G）和703 bP（A↔C）处各有一个碱基颠换（transversion）；4处插入/缺失分别为：65bP和138bP处的单碱基的插入/缺失、247~277 bP（31 bP）之间和288~289 bP（2bP）之间的多碱基的插入/缺失。

2.2 遗传多样性分析

利用TCS1.2软件构建了cpDNA RPL32-TRNL的单倍型网络图（图1）。位于分支内部的古老单倍型H1分布在大叶茶5个居群和大理茶2个居群中，为分布范围最广、出现频率最高（36.2%）的单倍型。位于分支末端的单倍型H4在大叶茶6个居群中都有分布，是大叶茶中分布范围最广、出现频率最高的单倍型。单倍型H1和H6为大理茶和大叶茶两个分类单元所共有，单倍型H2、H3、H4和H5四种单倍型只出现在大叶茶居群中，而单倍型H7仅分布在大理茶居群中。单倍型H5和H7与单倍型H1间都仅存在一个碱基的差异，其中单倍型H5仅含有来自居群YX中2条序列；单倍型H7中的9条序列则全部来自于大理茶居群TDH（表3）。

遗传多样性的分析结果表明（表3），栽培大叶茶的单倍型多态性水平（h=0.728）和核苷酸多态性水平（π=0.00469）均高于栽培大理茶（h=0.610， π=0.00225）。栽培大叶茶居群间的遗传多样性水平也存在较大差异，单倍型多态性水平（h）变化范围为0~0.809，而核苷酸多态性水平（π）变化范围为0~0.00487。其中，居群JM的单倍型多态性水平（h＝0.809）和核苷酸多态性水平（π=0.00487）最高，而居群NNS、JC和YW中都只含有一种单倍型，单倍型多态性水平和核苷酸多态性水平均为零。而在栽培大理茶中，除居群TDL（h=0.500， π=0.00389）外，其余两个居群（TC-NT和TDH）的单倍型多态性水平和核苷酸多态性水平均为零。

2.3 居群遗传结构分析

居群遗传结构分析结果表明，栽培大叶茶和栽培大理茶的居群间均存在着较高水平的遗传分化，栽培大理茶的居群遗传分化系数（Gst=0.696）高于栽培大叶茶（Gst=0.580）。栽培大叶茶和栽培大理茶的Nm值分别为0.18和0.11，表明它们居群间的基因流受阻。

AMOVA分析结果表明（表4），遗传变异主要存在于分类单元内居群间，高达60.12%；分类单元间遗传变异仅为7.99%，居群内的遗传变异为 31.90%。分类单元间居群间遗传变异固定指数Fst和分类单元内居群间遗传变异固定指数Fsc分别为0.681和0.653，均达到极显著水平（P<0.001），表明分类单元间居群间和分类单元内居群间遗传分化水平较高。分类单元间遗传变异固定指数Fct=0.080（P>0.05），表明栽培大理茶和栽培大叶茶之间不存在明显的遗传分化。栽培大理茶居群内的遗传变异水平（22.66%）低于栽培大叶茶（38.79%），栽培大理茶居群间遗传变异固定指数（Fst=0.773,P<0.001）高于栽培大叶茶（Fst=0.612,P<0.001），表明栽培大理茶和栽培大叶茶居群间均存在着显著的遗传分化。Mantel检验结果表明栽培大叶茶（r=0.225, P>0.05）和栽培大理茶（r=0.416, P>0.05）的居群间遗传分化系数Fst与地理距离之间均不存在着显著的相关性。

3 讨论

3.1 遗传多样性和居群遗传结构分析

叶绿体基因组常被看作是一个独立的遗传单位，不经受遗传重组，有利于进行遗传分析（Schaa，1998）。尤其是叶绿体基因组上的一些非编码区域具有较快的进化速率，能区分出种内多种单倍型，适合于植物近缘种间和种内的亲缘关系和遗传多样性研究，如Katoh等（2003）通过对来自8个国家的118份茶树种质资源的叶绿体DNA matK非编码区域序列的比较，得到了10种不同的叶绿体单倍型。Shaw等（2007）对不同植物叶绿体基因组上的34个非编码区域的序列进行了比较，发现RPL32-TRNL区域的变异最为丰富，非常适于较低分类单元的亲缘关系研究（Falchi等，2009; Sosa等，2009）。Petit等（2005）收集了不同植物居群的遗传多样性资料，得到了植物平均cpDNA遗传多样性（Ht=0.67）。本研究对来自94个个体的RPL32-TRNL序列进行了分析，发现栽培大叶茶的单倍型多态性水平（h=0.728）高于植物平均cpDNA的遗传多样性水平，而栽培大理茶的单倍型多态性水平（h=0.610）低于平均 cpDNA的遗传多样性水平（Petit等，2005）。